PCR基因擴增實驗室介紹和標準：

   PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別。

   PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行.                    

PCR設(shè)計規(guī)范 /PRINCIPLES

配置原則	室全PCR線實驗(高檔實驗室)	標準PCR實驗室（中檔實驗室）	普通實驗室（普通實驗室）	測序?qū)嶒炇遥▽？茖嶒炇遥?/span>
開展項目	涵蓋了目前分子生物學(xué)能開展所有項目，達到國內(nèi)甚至國際一流CR實驗室水平。	檢測項目齊全，涵蓋了目前臨床需求的常規(guī)檢測項目，達到國內(nèi)PCR標準實驗室的檢測水平。	臨床科室或小型醫(yī)院開展PCR項目，檢測項目滿足臨床需求，達到或達不到國內(nèi)PCR標準實驗室的標準。	開展測序的所有檢測項目，達到標準PCR實驗室水平
項目先進性	除開展常規(guī)的檢測項目外，還需開展高端項目，如測序項目、超敏PCR項目、腫瘤檢測等高端項目。	開展項目技術(shù)性能基本滿足臨床需求，達到國內(nèi)PCR標準實驗室的檢測水平。	開展項目技術(shù)性只能滿足科室或小型醫(yī)院的當前需求，不具有先進性。	國內(nèi)外最先進的PCR測序檢測項目，達到個體化診療的需求。
人員要求	至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。

 

PCR基因擴增實驗室技術(shù)參數(shù)：
 

區(qū)域	壓力	溫度	相對濕度	照明
PCR走廊	+5-0Pa	20-26度	40-60%RH	主實驗室≥300LX，其余房間20-300LX
PCR試劑準備區(qū)	+10Pa
PCR樣品制備區(qū)	+15Pa
PCR擴增及擴增產(chǎn)物分析區(qū)	-15-250Pa

基因擴增檢驗實驗室平面布局

1）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則

1、 試劑儲存和準備區(qū)                                                          

2、 標本制備區(qū)

3、 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)                                

4、 擴增產(chǎn)物分析區(qū)

如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。

2） 各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

3） 進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū) —>標本制備區(qū)—>擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)—>擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

4） 不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。

                      PCR基因擴增實驗室平面圖

PCR擴增檢驗實驗室原則上分為三個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。

(1)試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)應(yīng)對外界保持微正壓。

(2)標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

(3-4)擴增和擴增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。

  PCR區(qū)完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。

(5)緩沖區(qū)與沖洗區(qū)

整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

  可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。外面有用于實驗后消毒，消毒區(qū)域有專用清洗液和專用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。

若房間進深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。

   各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。

以下以疾控中心PCR基因擴增實驗室的整體建設(shè)：

1、主體結(jié)構(gòu)：

主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

2、 標準的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：

將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增、分析三個（或）四個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。

3、 消毒：

在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。

4、 機械連鎖不銹鋼傳遞窗：

試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

5、 地面

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

6、 照明

燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。

生物安全標識                                                  

產(chǎn)物擴增區(qū)

 PCR標本制備區(qū)                                        

 PCR緩沖區(qū)

 PCR洗手消毒區(qū)                                          

 PCR沐浴換衣區(qū)

 PCR通風與消防區(qū) （不同區(qū)域工作人員衣服不同）                    

 PCR負壓控制區(qū)

在建設(shè)的過程中應(yīng)注意：

●規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。

●嚴格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計的安裝流程。

●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風口尺寸。

PCR 即聚合酶鏈式反應(yīng)，是分子生物學(xué)研究和實驗的常規(guī)方法，也是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的實驗技術(shù)。其特點是能將微量的DNA大幅增加。實驗室分為四個區(qū)域，進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出，

PCR整體實驗室區(qū)域分別為：

1.試劑配制區(qū)?

2.樣品處理區(qū)?

3.核酸擴增區(qū)?

PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。

一、分散形式PCR實驗室

   所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。

       

二、組合形式PCR實驗室

   所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品。

如果使用熒光PCR儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。

   若房間進深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。

   各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。  

實驗室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求.。

PCR實驗室設(shè)置和驗收

 擬設(shè)置臨床基因擴增檢驗實驗室的醫(yī)療機構(gòu)按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》籌建實驗室；籌建完成后，由法定代表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗收申請。

申請時需提交以下材料：

（一）《醫(yī)療機構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》復(fù)印件；

（二）可行性研究報告；

1、 擬設(shè)臨床基因擴增檢驗實驗室機構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機構(gòu)的基本情況、對臨床基因擴增檢驗的需求以及臨床基因擴增實驗室運行的預(yù)測分析；

2、 擬設(shè)臨床基因擴增檢驗實驗室的設(shè)置平面圖；

3、 擬設(shè)臨床基因擴增檢驗實驗室將開展的檢驗項目、實驗設(shè)備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料

PCR實驗室驗收條件：

1 根據(jù)衛(wèi)生部臨檢中心規(guī)定，凡是根據(jù)需要開展PCR檢測實驗室建設(shè)的醫(yī)療機構(gòu)均通過衛(wèi)生臨床檢驗中心實驗室驗收并取得合格證書方可開展工作。二級以上醫(yī)院方可設(shè)立PCR實驗室，含專科醫(yī)院。

2驗收規(guī)定：

三級醫(yī)院由衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織專家（一般均為各省臨床檢驗中心主任）進行，二級醫(yī)院由各個省臨床檢驗中心組織專家（一般為本省醫(yī)療機構(gòu)主任級別專家）進行驗收。按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》對提出申請的臨床基因擴增檢驗實驗室進行技術(shù)驗收。驗收完成后，在20日內(nèi)將驗收報告寄送至申請機構(gòu)。

驗收人員組成：一個驗收小組一般為3人，其中一人為聯(lián)絡(luò)小組組長，其他為其他省臨床檢驗中心主任或者本省醫(yī)院內(nèi)任職專家。

PCR實驗室所在科室規(guī)定：根據(jù)規(guī)定，PCR檢測應(yīng)該由各醫(yī)院的檢驗科開展，其他科室如傳染科，皮膚科等，要求開展并申請驗收的，應(yīng)該事先由各省臨床檢驗中心認可。

PCR實驗室人員規(guī)定：根據(jù)規(guī)定，PCR實驗室操作人員至少2名，且有PCR上崗培訓(xùn)合格證。

PCR實驗室設(shè)備：PCR實驗室內(nèi)所需要的醫(yī)療設(shè)備均需要取得相關(guān)醫(yī)療器械注冊許可證，檢測試劑均需要取得新藥證書和藥品生產(chǎn)文號，熒光定量PCR不得使用超過五年。

PCR實驗室認證實施規(guī)定：

PCR實驗室認證驗收時，均會給定未知標本5份（一般是HBV-DNA，可能是近一兩年的衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)控品），要求待認證實驗室做實驗并打印報告單作為驗收的重要實驗依據(jù)。一般要求5份標本的定量結(jié)果必須在范圍值之內(nèi)，否則不合格。

PCR實驗室各區(qū)域管理規(guī)定：

試劑準備區(qū)工作制度  

一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿本區(qū)專用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、實驗員在試劑準備區(qū)接收標本、準備實驗用的試劑。

三、實驗員每天收齊標本，驗收登記后，將標本通過傳遞 窗送入標本制備區(qū)。  四、在試劑準備區(qū)配置好試劑后放入冰箱內(nèi)備用。需要時 通過傳遞窗送入標本制備區(qū)。

五、每天的標本及配置的試劑須登記記錄，應(yīng)書寫工整詳 細，使用本區(qū)專用的、帶有本室標識的記錄本、紙和筆。

六、將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出 實驗室交醫(yī)院集中處理。

七、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。

  

標本制備區(qū)工作制度  

一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用藍色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、把已準備好的試劑放入冰箱試劑存放專區(qū)暫存。

三、記錄溫濕度計讀數(shù)、冰箱的溫度。

四、嚴格按照SOP文件及試劑盒要求進行實驗操作，加樣好的PCR 管須通過傳遞窗送入擴增及產(chǎn)物區(qū)。

五、使用本區(qū)專用的移液器及吸頭，使用過的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實驗完畢后及時處理。將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出實驗室交醫(yī)院集中處理。

六、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。

七、實驗完畢關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。

八、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。    

擴增及產(chǎn)物分析區(qū)工作制度  

 一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、記錄溫濕度計讀數(shù)、冰箱的溫度。

三、本區(qū)主要進行目的基因的擴增及分析，須熟悉各擴增儀 的使用，擴增分析完后，記錄結(jié)果。

四、得到當天室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果后，及時記錄在室內(nèi)質(zhì)控圖上并 進行分析。

五、試驗完畢后關(guān)掉擴增儀，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。

六、每周由實驗室負責人對進行清潔維護并記錄。

七、擴增分析完后的反應(yīng)管，須裝入本室垃圾袋中，有專人 將垃圾帶出實驗室交醫(yī)院集中處理。

八、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。

九、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。